ПОЛИТРАВМА / POLYTRAUMA

• Главная
• О журнале
• Вход
• Регистрация
• Поиск
• Новости
• Статистика

Главная > № 4 (2019) > Самодай

Самодай В.Г., Стариков А.О., Калашников П.И.

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России, г. Воронеж, Россия 

ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫЕ АЛЛОГЕННЫЕ ФАКТОРЫ РОСТА В ТРАВМАТОЛОГИИ И ОРТОПЕДИИ КАК ПЕРСПЕКТИВНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ

В последние годы проблема высокоэнергетической травмы во всем мире принимает угрожающие масштабы. Это связано с ускоренной урбанизацией, развитием технического прогресса и увеличением в связи с этим количества техногенных катастроф, а также с всё большим преобладанием в структуре травматизма высокоэнергетической травмы.
При политравме, определенной как сочетанная травма, скелетные повреждения встречаются в 93 % случаев [1], в половине (50 %) случаев происходит замедленная консолидация, а затем и образование псевдоартрозов [2-4]. Несмотря на огромный вклад сил и средств в профилактику травматизма, тенденции к снижению числа пациентов с замедленной консолидацией и образованием псевдоартрозов не наблюдается [5]. В такой ситуации остается актуальным вопрос о способах борьбы с осложнениями, неизбежно возникающими в результате лечения сочетанных травм.
Лечение пациентов с ложными суставами и возврат их к нормальному образу и ритму жизни занимает от одного года и более, что, естественно, приводит к большим экономическим затратам [6]. В результате возникает потребность в развитии новых технологий, позволяющих нормализовать регенерацию костной ткани.
В настоящее время активно изучаются именно эндогенные факторы, влияющие на репаративный процесс. Эти факторы находятся в гармонии между собой, в уникальном природном соотношении. Предложение использования Богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) в 1965 г. Marshall R. Urist и открытие в 1986 г. факторов роста (Рита Леви-Монтальчини, Стэнли Коэн), участвующих в регенерации тканей, позволили сделать новый шаг в развитии лечения повреждений, причем как мягких структур, так и костной ткани.
Известно, что тромбоциты играют важную роль в заживлении поврежденных тканей организма, высвобождая при их адгезии и разрушении из альфа-гранул факторы роста [7, 8], которые стимулируют гистиогенез, хемотаксис и дифференцировку клеток [9].
Как правило, для PRP (Platelet Rich Plasma) терапии используется именно аутокровь. Однако использование данного метода лечения ограничено у пациентов, ослабленных соматической патологией и тяжестью состояния. Часто нарушение регенеративной способности встречаются именно у таких пациентов.
Одна из главных проблем в использовании аутоБоТП – невозможность длительного хранения и заготовки «про запас». Срок хранения тромбоцитов составляет не более 3 дней. Увеличение этого срока провоцирует выброс провоспалительных цитокинов и других нежелательных для терапии веществ [10, 11].
Основные проблемы применения аутоБОТП заключаются в ограниченных сроках хранения, времени приготовления от момента взятия цельной крови до введения пациенту, стоимости производства плазмы. По нашему мнению, поиск пути решения данных проблем начинается с изучения действия PRP, полученной из аллогенной крови.
На кафедре травматологии и ортопедии Воронежского государственного медицинского университета им. Н.Н. Бурденко с 2005 года ведется работа по изучению проблем, связанных с замедленной консолидацией переломов и псевдоартрозами, а также исследование методов нормализации репаративного остеогенеза [12-18].
Сейчас по многим проблемам трансплантологии ведутся дискуссии, и до сих пор остается открытым вопрос о развитии иммунного ответа на введение аллогенного БоТП или возникновении спонтанной трансплантационной толерантности. Тромбоцит – клеточная структура, соответственно, введение аллоБоТП будет подчиняться всем законам и принципам трансплантологии и иммунологии.
Иммунный гомеостаз достигается путем непрерывного взаимодействия системного анализа и предыдущего опыта организма. Установлено, что аллоантигены не распознаются системой врожденного иммунитета [19].
Активация прямого иммунитета возникает сразу после трансплантации. Донорские лейкоциты-пассажиры из трансплантата мигрируют в лимфоцитарные органы и созревают, приобретая функции донороспецифических антигенпрезентирующих клеток (АПК). Доказано, что большинство иммунных процессов связаны с наличием иммунокомпетентных клеток – лейкоцитов. Трансфузии тромбоцитов сами по себе не могут вызвать выработку HLA антител, так как они не содержат антигенов 2 класса, необходимых для Т-хелперной активации В-клеток и продукции антител [20].
Существует процесс лейкодеплекции, применяемый сегодня в процессе приготовления тромбоцитарных концентратов. Фильтры в аппаратах афереза препятствуют появлению лейкоцитов в концентрате, что делает применение аллоБоТП еще более привлекательным с позиции иммунного ответа [21].
При реализации непрямого пути в АПК реципиента происходит процессинг донорских белков, синтез которых контролируется минорными генами гистосовместимости. Как известно, активация непрямого пути представляет ведущую роль в развитии хронического отторжения. Для второго пути сенсибилизации реципиента необходима антигенная презентация посредством клеток, экспрессирующих HLA 2 класса, которого в тромбоцитах нет [10, 20].
В доступной мировой литературе уже есть информация о применении аллоБоТП в направленной регенерации тканей [23-26]. Исследована эффективность комбинации аллогенной богатой тромбоцитами плазмы с коллагеном при лечении дефектов бедренной кости у крыс [27].
Использование аллоБоТП значительно упрощает схему приготовления и применения PRP, так как используется донорская кровь. Но проблема хранения все также актуальна.
Одним из перспективных методов сохранения функциональности факторов роста является сублимационное высушивание. Лиофилизация – современный метод сухого высушивания веществ, при котором субстанция замораживается и в вакуумных условиях возгоняется растворитель. Из-за отсутствия воздействия высоких температур, белок не денатурирует и сохраняется без потери своей структурной и функциональной целостности. Лиофилизированные ткани и препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства [28]. На кафедре травматологии и ортопедии ВГМУ имени Н.Н. Бурденко в 2012 году разработана «Технология лиофилизации обогащенной тромбоцитами плазмы с сохранением жизнеспособности факторов TGF, PDGF, VEGF» [18]. Доказано, что при лиофилизации белковая структура факторов роста сохраняется. В лиофилизированной плазме концентрация факторов роста почти такая же, как в аутоPRP [4]. Мы предполагаем, что аллоЛТФР (лиофилизированные тромбоцитарные факторы роста, полученные из аллогенной крови) способны стимулировать остеогенез также, как и аутоPRP, и сохраняются неограниченно долго. В нашем эксперименте лиофилизат хранился при комнатной температуре ~26°С в течение 16 дней. Применять лиофилизат возможно в совершенно любой форме: гель, порошок или раствор, что делает процедуру не только эффективной, но и простой.
За рубежом предложен способ приготовления аллоЛТФР [29], однако использование в практике данной разработки невозможно, так как отсутствует информация о проведении исследования и наличии доказательной базы по безопасности препарата.
Цель исследования – разработать методику стимуляции остеогенеза при переломах длинных трубчатых костей с использованием комплекса аллогенных лиофилизированных факторов роста в эксперименте.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент проводили на базе НИИ ЭБМ ВГМУ им. Н.Н. Бурденко на кафедре травматологии и ортопедии в 2018-2019 годах в два этапа.
Протокол эксперимента, содержания и выведения животных из опыта был составлен в соответствии с принципами биоэтики и правилами лабораторной практики, представленными в «Руководстве по содержанию и использованию лабораторных животных» (1996 г.) и приказе МЗ РФ № 266 от 19.06.2003 г. Все манипуляции проводились с соблюдением правил гуманного обращения с животными (Report of the AVMA Panel on Euthanasia JAVMA, 2001 г.), в соответствии с требованиями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Директива 86/609 ЕЕС). Копии всех материалов хранятся у авторов. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко г. Воронеж (протокол № 3 от 15 ноября 2018 года).
Для проведения I этапа эксперимента нужен подсчет концентрации тромбоцитов в используемой плазме у лабораторных животных. В среднем у лабораторных крыс, участвующих в I этапе эксперимента (по нашим лабораторным данным) в крови содержится 5,0-8,5 × 10⁸ тромбоцитов/мл. При приготовлении аллоЛТФР их концентрация увеличивается примерно в 3 раза. Известно, что в каждом тромбоците содержится 1200 молекул PDGF массой 26-30 кДа [30]. Рассчитав массу PDGF в 1 мл цельной крови, получаем 15,6 × 10¹² – 30,6 × 10¹² кДа. Известно, что для стимуляции направленного действия в регенерации достаточно содержания PDGF 5-20 нг/мл [31]. Для доказательства эффективности нашей методики требуется перевести кДа в нг. Известно, что 1 кДа равен 1,66043 ± 0,0031 × 10^-12 нг. [32]. Тогда выходит, что в 1 мл цельной крови получается концентрация PDGF 25,9-50,8 нг/мл. И, соответственно, из 0,5 мл можно получить 12,95-22,415 нг PDGF. Таким образом, можно сделать вывод, что объема 0,5 мл цельной крови, используемой для приготовления ЛТФР, достаточно для влияния на репаративный остеогенез.
Для I (первого) этапа исследования (забор крови у животных и приготовление лиофилизата аллоБоТП) было взято 5 конвекциональных нелинейных стоковых крыс-самцов 10-месячного возраста. Манипуляции производили под ингаляционным наркозом раствором изофлурана с обеспечением дополнительного поступления кислорода для предотвращения удушья. После наступления хирургической стадии наркоза выстригали шерсть в области предполагаемой пункции и дезинфицировали кожу спиртовым раствором хлоргексидина. Пальпаторно определяли сердечный толчок и осуществляли взятие крови пункцией сердца с использованием вакуумных контейнеров, содержащих 3,8 % цитрат натрия [33]. Итого в эксперименте использовалось 30 мл цельной крови, разделенной на 5 стерильных пробирок, по 6 мл соответственно каждой группе.
Далее из полученной цельной крови получали БоТП по методу Мessora [34]. Пронумерованные пробирки одновременно центрифугировали с моментом 160 g в течение 20 минут (рис. 1). Отделившаяся плазма была отобрана в пустые стерильные пробирки. Повторное центрифугирование пробирок проводили с моментом 400 g в течение 15 минут (рис. 2). Отбирали нижнюю фракцию, где концентрация тромбоцитов составляла от 15,0-29,0 × 10⁸ тромбоцитов/мл. Полученный в результате центрифугирования тромбоцитарный концентрат быстро замораживали в холодильной камере при температуре -40°C. После чего подвергали сублимационной сушке в лиофильной камере ЛС-1000 в течение минимум пяти минут в диапазоне температур от 2°C до 30°C (рис. 3). Полученный лиофилизат (5 пробирок) стерилизовали в озоновой камере «Орион» с экспозицией не менее 140 минут, далее его помещали в стерильный герметичный контейнер, хранили в сухих условиях.

Рисунок 1. Результаты центрифугирования пробирки с моментом 160gв течение 20 минут

Рисунок 2. Результат повторного центрифугирования с моментом 400 gв течение 15 минут

 

Рисунок 3. Лиофиллизированные аллогенные факторы роста, полученные из аллогенной крови

 

Во II (втором) этапе эксперимента участвовали 10 подгрупп лабораторных животных, в которые входили нелинейные конвекциональные крысы 5-6-месячного возраста, весом в 450-550 г, самцы, по 12 крыс в подгруппе (табл. 1).

Таблица  1. Характеристика исследуемых групп лабораторных животных 

Характеристика групп	Номер  подгруппы	Сроки оценки остеогенеза после остеоклазии	Кол-во животных
Экспериментальная группа	`1.1	5-е сутки	12
	`1.2	14-е сутки	12
	`1.3	21-е сутки	12
	`1.4	32-е сутки	12
	`1.5	44-е сутки	12
Контрольная группа	`2.1	5-е сутки	12
	`2.2	14-е сутки	12
	`2.3	21-е сутки	12
	`2.4	32-е сутки	12
	`2.5	44-е сутки	12

1 группа – экспериментальная (60 крыс) – с оценкой остеогенеза на 5-е сутки (12 крыс) (в дальнейшем авторы планируют использовать эту подгруппу для гистохимического анализа, так как в данный срок признаки костеобразования не видны, а иммуногенные процессы протекают в полном объеме), на 14-е сутки (12 крыс), на 21-е сутки (12 крыс), на 32-е сутки (12 крыс), на 44-е сутки (12 крыс);
2 группа – контрольная (60 крыс) – 5 подгрупп по 12 особей животных (соответственно аналогичным срокам экспериментальных подгрупп).
До начала эксперимента производили наблюдение за животными в течение 2 недель. Животных помещали в небольшую клетку с ограниченной площадью для перемещения. Кормление животных производили по имеющимся стандартам, одинаково в обеих группах. Все манипуляции проводили под наркозом, экспозицией изофлурана. Производили ручную остеоклазию правой бедренной кости, формируя закрытый перелом с-н/3 бедра. АллоЛТФР из каждой пробирки разводили в 6 мл 0,9 % NaCl и полученный раствор вводили в область перелома в объеме 0,25 мл на первые и вторые сутки после остеоклазии. В контрольной группе использовался раствор 0,9 % NaCl в объеме 0,25 мл аналогично экспериментальной группе. Перед выведением животных из эксперимента были выполнены рентгеновские снимки в одной проекции с использованием стационарной ветеринарной рентгенологической системы HF-525plus EcoRay в режиме 30 mA 0.07 kB с экспозицией в 1 сек. Во время рентгенографии животные находились в наркозе, снимки выполняли в положении животного на спине, исследуемую конечность вытягивали вдоль туловища (рис. 4). Группы были выведены из эксперимента путем применения летальной экспозиции изофлурана. Производили экзартикуляцию конечности в тазобедренном суставе. Фрагмент кости вместе с костной мозолью фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, после чего погружали в декальцинирующую среду. Далее проводили стандартную процедуру проводки и заливали материал в парафин. Парафиновые среды толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином эозином и по методике Массона. Микроскопию проводили на световом микроскопе с установленным на нем оборудовании для проведения микрофотографии. Полученную в результате микроскопии информацию обрабатывали на персональном компьютере с использованием программы ImageG, при помощи этой же программы проводили морфометрию.

Рисунок 4. Рентгенография животных в положении на спине, исследуемую конечность вытягивали вдоль туловища

Для количественной и качественной оценки репаративного остеогенеза были подсчитаны площади соединительнотканного компонента гиалинового хряща и компактной костной ткани для оценки динамики по абсолютным и относительным показателям. Также был произведен подсчет общего числа хондроцитов и остеоцитов, обнаруженных в ткани исследуемых костных мозолей. Для информационной интерпретации полученных результатов проведен морфолого-статистический анализ на ПЭВМ с помощью пакетов программ Statistica 8.0, SSPS 13, с использованием параметрических критериев. Данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартной ошибки средней (m). Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента, считая статистически достоверным значение p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рентгенографическом исследовании, выполненном в обеих группах на 5-е сутки, наблюдается схожая картина. Линия перелома прослеживается четко, края отломков заострены. Признаки образования костной мозоли не визуализируются. В связи с этим можно констатировать, что рентгенологических признаков начала консолидации перелома в обеих группах нет. На 14-е сутки (рис. 5) на рентгенографическом исследовании поврежденного бедра отличий между экспериментальной группой и группой контроля также нет. Однако видно, что репаративный процесс уже начался, линия перелома еще прослеживается, края отломков сглажены. Контуры кортикального слоя прерывистые, что говорит о гипертрофии надкостницы и начале формирования периостальной мозоли.

Рисунок 5. Рентгенография поврежденного бедра на 14-е сутки: (слева) контрольная группа, (справа) экспериментальная

 

Ренгенографическое исследование на 21-е сутки эксперимента (рис. 6), показало, что, несмотря на значительное смещение отломков, наблюдается усиление регенерации тканей в области перелома в экспериментальной группе. Линия перелома в этой группе не прослеживается. Видна периостальная реакция. Однако у контрольной группы линия перелома еще прослеживается, разряженность костной ткани в зоне перелома указывает на остеопению.

Рисунок 6. Рентгенография перелома на 21-е сутки: (слева) группа контроля, (справа) экспериментальная группа

 

На 32-е сутки на рентгенограммах (рис. 7) определяется выраженная костная мозоль перелома у животных экспериментальной группы. В контрольной группе рентгенологическая картина практически полностью соответствует той, что наблюдалась у экспериментальной группы на 21-й день, что указывает на отставание процесса регенерации примерно на 10-12 дней.

Рисунок 7. Рентгенография на 32-е сутки эксперимента: (слева) группа контроля,(справа) экспериментальная группа

 

На 44-е сутки на рентгенограммах у животных экспериментальной группы произошло полное сращение перелома (рис. 8). Линия перелома не различима. Явные признаки сформированной параосальной мозоли. У животных контрольной группы наблюдается картина продолжающегося формироваться костной мозоли. Рентгенологическая картина соответствует картине консолидации перелома у животных экспериментальной группы на 32-й день.

Рисунок 8. Рентгенография на 44-е сутки эксперимента: (слева) группа контроля,(справа) экспериментальная группа

Количественный анализ тканевого состава костной мозоли осуществлялся путем подсчета абсолютного и относительного показателей площади соединительной, хрящевой и костной ткани, общего числа хондроцитов и остеоцитов. У животных контрольной группы на 14-е сутки в тканевом составе костной мозоли выявлено преобладание плотной волокнистой соединительной ткани (ПВСТ), костная ткань отсутствовала (табл. 2, 3, рис. 9).

Таблица 2. Соотношение тканевых компонентов и их площадь в мкм

	14-е сутки			21-е сутки			32-е сутки			44-е сутки
	Площадь соединительной ткани (мкм)	Площадь гиалинового хряща	Площадь костной ткани (мкм)	Площадь соединительной ткани (мкм)	Площадь гиалинового хряща (мкм)	Площадь костной ткани (мкм)	Площадь соединительной ткани (мкм)	Площадь гиалинового хряща (мкм)	Площадь костной ткани (мкм)	Площадь соединительной ткани (мкм)	Площадь гиалинового хряща (мкм)	Площадь костной ткани (мкм)
Контроль	427.81	11.03	0	341.5	195.2917	110.9583	259.43	191.97	137.62	237.875	184	169.5
	97 %	3 %		53 %	30 %	17 %	44 %	33 %	23 %	40 %	31 %	29 %
Эксперимент	286	41.7	13.64	204.875	237.7083	196.4167	197.98	211.35	201.2	187.7083	183.5833	209.1667
	84 %	12 %	4 %	32 %	37 %	31 %	32 %	35 %	33 %	32 %	32 %	36 %

 

Таблица 3. Количество клеток в поле зрения (усл. ед.) 

	5-е сутки		14-е сутки		21-е сутки		32-е сутки		44-е сутки
	Кол-во хондроцитов	Кол-во остеоцитов	Кол-во хондроцитов	Кол-во остеоцитов	Кол-во хондроцитов	Кол-во остеоцитов	Кол-во хондроцитов	Кол-во остеоцитов	Кол-во хондроцитов	Кол-во остеоцитов
Контроль	0	0	8.34	0	220.7917	66.66667	974.56	101.39	1243.708	129.0833
Эксперимент	0	0	67.9	9.34	1863.125	188.3333	1234.83	279.22	385.0833	519.375

 

Рисунок 9. Зона перелома бедра крысы спустя 14 суток с момента остеоклазии. Контрольная подгруппа № 2.2, окраска гематоксилином-эозином, (х 100). Обширные поля грубоволокнистой соединительной ткани.

Показатели тканевого состава костной мозоли в экспериментальной группе на 14-е сутки отличались от данных контрольной: абсолютное и относительное количество ПВСТ было достоверно ниже, а площадь хрящевой и костной ткани увеличилась (табл. 2). Общее число хондроцитов и остеоцитов достоверно увеличилось в сравнении с контрольной группой (табл. 3, рис. 10).

Рисунок 10. Зона перелома бедра крысы спустя 14 суток с момента остеоклазии. Экспериментальная подгруппа № 1.2, окраска гематоксилином-эозином, (х 100). Широкая полоса соединительной ткани и островки формирования хряща.

В микропрепаратах области консолидации, изъятых у животных контрольной группы на 21-е сутки, были обнаружены незначительные фрагменты компактной костной ткани, в центре виден деятельный красный костный мозг, у одного из краев располагается костная мозоль, состоящая большей частью из ПВСТ с единичными полнокровными сосудами капиллярного типа, расположенными поверхностно (рис. 11).

Рисунок 11. Зона перелома бедра крысы спустя 21 сутки с момента остеоклазии. Контрольная подгруппа № 2.3, окраска гематоксилином-эозином, (х 100). Широкая надкостница и мелкие островки молодой хрящевой ткани

Также был проведен количественный анализ тканевого состава костной мозоли путем подсчета абсолютного и относительного показателей площади соединительной, хрящевой и костной ткани, а также общего количества хондроцитов и остеоцитов. В тканевом составе костной мозоли преобладала ПВСТ, на втором месте по отношению к общей площади была хрящевая ткань, костная ткань визуализируется в виде небольших островков рыхлых мелких костных балок (табл. 2, 3).
В микропрепаратах, полученных от животных экспериментальной группы на 21-е сутки наблюдения, видны фрагменты компактной костной ткани. В толще ПВСТ видны крупные островки гиалинового хряща, покрытые широкой надхрящницей с большим количеством хондробластов. Примерно в половине исследуемых препаратов видны участки формирующихся костных балок (рис. 12).

Рисунок 12. Зона перелома бедра крысы спустя 21 сутки с момента остеоклазии. Экспериментальная подгруппа № 1.3, окраска гематоксилином-эозином, (х 100). Крупные островки гиалинового хряща  и признаки начинающегося костеобразования.

 

Также от данных в контрольной группе отличались абсолютные и относительные показатели тканевого состава костной мозоли: абсолютное и относительное количество ПВСТ было достоверно ниже, однако соотношение хрящевой и костной ткани было практически одинаковым. Общее число хондроцитов и остеоцитов было также достоверно выше аналогичных показателей в группе временного контроля (табл. 2, 3).
Таким образом, на 21-е сутки наблюдения животных как контрольной, так и экспериментальной группы были обнаружены признаки формирования костной мозоли, однако в группе животных, которым не было произведено введение аллоЛТФР, она состояла преимущественно из ПВСТ с небольшим количеством мелких островков хрящевой ткани и единичными очажками костеобразования. В экспериментальной группе животных были более выражены признаки костеобразования, преимущественно на месте вновь образованной хрящевой ткани (рис. 9, 10).
При количественном анализе абсолютного и относительного показателей тканевого состава костной мозоли контрольной группы на 32-е сутки преобладала плотная волокнистая соединительная ткань, чуть меньше по отношению к общей площади занимала хрящевая ткань, а костная ткань была в виде небольших островков, рыхлых мелких костных балок (табл. 2, 3, рис. 13).

Рисунок 13. Зона перелома бедра крысы спустя 32 дня с момента остеоклазии. Контрольная подгруппа № 2.4, окраска гематоксилином-эозином, (х 100). Островки хрящевой ткани со «щелями» в центре, довольно большое количество соединительной ткани вокруг

 

При сравнении абсолютных и относительных показателей тканевого состава костной мозоли в экспериментальной группе отмечается достоверное снижение объема ПВСТ, показатели хрящевой и костной ткани достоверно выше. Также достоверно увеличилось количество хондроцитов и остеоцитов (табл. 2, 3, рис. 14).

Рисунок 14. Зона перелома бедра крысы спустя 32 дня с момента остеоклазии. Экспериментальная подгруппа № 1.4, окраска гематоксилином-эозином, (х 100). Хрящевая ткань в виде «полоски» формирование кости как из хряща, так и из соединительной ткани

В микропрепаратах, полученных из материала контрольной группы животных на 44-е сутки наблюдения, видно, что в толще соединительной ткани имеются крупные островки хрящевой ткани, покрытые относительно широкой надкостницей. Пространство между костными балками заполнено преимущественно рыхлой волокнистой соединительной тканью (рис. 15).

Рисунок 15. Зона перелома бедра крысы спустя 44 дня с момента остеоклазии. Контрольная подгруппа № 2.5, окраска гематоксилином-эозином, (х 100). «Полоска хряща» с признаками костеобразования с одной из сторон

В микропрепаратах, полученных от животных экспериментальной группы на 44-е сутки наблюдения отмечается гиалиновый матрикс – слабо выраженный, оптически плотный, с большим числом хондроцитов, у одного конца которого видны признаки формирования новых хондроцитов из хондробластов, а с другой стороны хондроциты подвергаются преобразованию в остеоциты (рис. 16).

Рисунок 16. Зона перелома бедра крысы спустя 44 дня с момента остеоклазии. Экспериментальная подгруппа № 1.5, окраска гематоксилином-эозином, (х 100). Активное костеобразование на месте тонкой полоски хряща

При проведении количественного анализа и определении относительных показателей было обнаружено, что площадь соединительной ткани у контрольных животных была выше, чем в экспериментальной группе, в то время как количество хрящевой ткани было примерно одинаковым. Однако площадь костной ткани в группе эксперимента была достоверно выше (табл. 2, 3).
Таким образом, можно сделать выводы, что морфологическая картина, а также количественная оценка тканевого состава костной мозоли у животных контрольной группы на 44-е сутки эксперимента сходна с таковыми у животных экспериментальной группы на 21-е сутки наблюдения (табл. 2, 3)
При проведении количественного анализа у животных экспериментальной группы на 44-е сутки и определении относительных показателей площади основных тканевых компонентов, входящих в состав костной мозоли соотношение соединительной, хрящевой и костной ткани было примерно одинаковым, причем площадь костной ткани была достоверно выше, чем у животных из группы временного контроля. Общее число хондроцитов и остеоцитов здесь имеет достоверную двунаправленную динамику по сравнению с общим числом этих клеток у животных контрольной группы, что указывает на терминальную фазу регенеративного процесса в костной ткани (табл. 2, 3)
Таким образом, на 44-е сутки эксперимента были выявлены признаки формирования костной ткани, которых не было в костной мозоли по сравнению с контрольной группой животных, о чем свидетельствует наличие большого количества участков костеобразования как на месте хряща, так и из соединительной ткани. Также в группе животных, получавших аллоЛТФР, было обнаружено большое число сосудов в толще костной мозоли, которые, вероятно, усиливали трофику и способствовали более скорому костеобразованию.
По полученным данным можно констатировать достоверность изменения площади каждой из стромальных тканей по отношению к предыдущему сроку на уровне р < 0,05.
Так, для соединительной ткани (контроль) изменения площади соединительной ткани являются достоверными и динамичными на сроках от 5-х до 14-х суток и от 14-х до 21-х суток, а также от 21-х к 32-м суткам. Изменения площади соединительной ткани на 44-е сутки относительно показателей 32-х суток есть, но они не являются достоверно значимыми (р > 0,05). По изменению площади соединительной ткани (эксперимент) достоверно значимые изменения прослеживаются только между показателями от 14-х к 21-м суткам, по всем остальным срокам изменение площади соединительнотканного компонента было незначительным и недостоверным).
Изменение площади гиалиновой хрящевой ткани у контрольных групп животных носило достоверный характер по срокам от 14-х до 21-х суток, по всем остальным срокам изменение площади было однонаправленным и проявляло тенденцию к снижению без достоверных изменений относительно предыдущего срока наблюдения. Площадь гиалинового хряща для экспериментальной группы животных показывала достоверно значимые изменения по срокам от 14-х к 21-м и от 32-х к 44-м суткам, тогда как изменение площади гиалинового хряща с 5-14-х и 21-х суток по 32-е было незначительное (р > 0,05).
Изменение площади костной ткани в контрольной группе животных носило достоверный характер по всем срокам наблюдения. В экспериментальной группе животных достоверные изменения площади костной ткани выявлены на сроке 21-х суток относительно 14-х суток. В дальнейшем изменения площади костного компонента были незначительны и недостоверны на фоне общей тенденции повышения относительно предыдущих сроков. О выраженных достоверных изменениях площади костной ткани можно говорить по всем срокам наблюдения относительно 14-х суток эксперимента (р < 0,05).
Площадь первичной хрящевой мозоли, образованной хондроцитами и остеоцитами в экспериментальной группе достоверно больше относительно контрольной группы на 14-е сутки эксперимента, а затем снижается в хронодинамике наблюдения до минимальных значений к 21-м суткам, оставаясь достоверно ниже таковых значений в контроле (рис. 17).

Рисунок 17. Количество хондроцитов и остеоцитов в хронодинамике эксперимента. Примечание: * на графике это обозначение достоверности изменений относительно контрольной группы по тому же сроку при р < 0,05.

 

Таким образом, скорость образования хрящевой мозоли, состоящей из зрелых хондроцитов, наиболее выражена в первые сроки наблюдения в экспериментальной группе в сравнении с контролем (p < 0,05).
Общая площадь гиалинового хряща в зоне сращения достоверно повышалась спустя 21 сутки и была максимальной, постепенно уменьшаясь в объеме к концу эксперимента, оставаясь только в виде небольших островков. Показатели контрольной группы имели сходную динамику, но с отставанием приблизительно на десять дней (p < 0,05) (рис. 18).

Рисунок 18. Площадь соединительной и костной ткани области сращения перелома в хронодинамике эксперимента.



Примечание: * на графике это обозначение достоверности изменений относительно контрольной группы по тому же сроку при р < 0,05.

Процесс формирования кости на месте первичной костной мозоли у животных экспериментальной группы начинался на 21-е сутки наблюдения, имея небольшую площадь в виде островков в толще гиалинового хряща, тогда как в контрольной группе этот процесс был практически не заметен (p < 0,05).
Начиная с 21-х суток у животных экспериментальной группы число хондроцитов в поле зрения достоверно снижалось. Динамика изменения числа хондроцитов контрольной группы полностью повторяла опыт с незначительным отставанием.

ВЫВОДЫ:

1.      Аллогенная богатая тромбоцитами плазма в лиофилизированном виде способна стимулировать репаративный остеогенез. На это указывает анализ R-графических признаков, полученных в эксперименте в результате сравнения полученных данных в контрольной и экспериментальной группах животных. Рентгенологические и морфологические признаки остеогенеза в экспериментальной группе опережают картину регенерации в контрольной группе примерно на 10-12 дней. Это указывает на стимулирующее влияние аллоЛТФР на регенеративную способность костной ткани.
2.      Одно из главных преимуществ использования аллоБоТП – возможность длительного хранения и заготовки «про запас». Это позволит применять препарат повсеместно по мере надобности в любом медицинском учреждении и даже амбулаторно.
3.      Получение аллоБоТП достаточно простой технологический процесс, не требующий крупных затрат на оборудование и хранение препарата.
4.      АллоЛТФР не просто способны нормализовать остеогенез, также как и традиционная аутоPRP, но могут быть использованы у пациентов, ослабленных соматической патологией и тяжестью состояния, так как для приготовления препарата используется исключительно донорская кровь.
5.      Лиофилизат можно использовать не только в виде порошка или геля, но и инъекционно в растворе. Это является наиболее удобным и малоинвазивным способом доставки препарата к месту повреждения или формирующегося псевдоартроза и делает процедуру не только эффективной, но и простой.
6.      Проведенный эксперимент с применением аллогенного лиофилизата факторов роста клинически, рентгенологически и морфологически не выявил каких-либо побочных эффектов. Можно констатировать факт отсутствия реакции со стороны иммунной системы в ответ на введение аллоЛТФР.
7.      Проведенная статистическая обработка результатов исследований позволяет считать эффективность использования комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов доказанной.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Исследование не имело спонсорской поддержки.
Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

ЛИТЕРАТУРА:

1.  Sokolov VA. Multiple and associated injuries. M.: GEOTAR-Media. 2006. 512 p. Russian (Соколов В.А. Множественные и сочетанные травмы. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2006. 512 с.)
2.  Metsemakers WJ, Handojo K, Reynders P, Sermon A, Vanderschot P, Nijs S. Individual risk factors for deep infection and compromised fracture healing after intramedullary nailing of tibial shaft fractures: a single centre experience of 480 patients. Injury. 2015; 46(4): 740-745
3.  Šmejkal K, Lochman P, Trlica J, Novotný P, Šimek J, Dědek T. Impaired healing after surgery for femoral fractures. Acta Chir.Orthop Traumatol Cech. 2015; 82(5): 358-363
4.  Märdian S, Rau D, Schwabe P, Tsitsilonis S, SimonP. Operative therapy of fractures of the distal femur. Predictive factors for a complicated course. Orthopadie. 2016; 45(1): 32-37
5.  Balayan VD. Treatment of false joints of long tubular bones of extremities with the use of stimulation of bone formation under conditions of stable fixation: Abstract of the dissertation for the academic degree of Candidate of Medicine. Saratov, 2011. 25 p. Russian (Балаян В.Д. Лечение ложных суставов длинных трубчатых костей конечностей с использованием стимуляции костеобразования в условиях стабильной фиксации: автореф. дис. … канд. мед. наук. Саратов, 2011. 25 с.)
6.  Tay WH, de Steiger R, Richardson M, Gruen R, Balogh ZJ. Health outcomes of delayed union and nonunion of femoral and tibial shaft fractures. Injury. 2014; 45(10): 1653-1658
7.  ZotikovEA, Babaeva AG, Golovkina LL. Platelets and antiplatelet antibodies. M.: Monolit, 2003. 128 p. Russian (Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Головкина Л.Л. Тромбоциты и антитромбоцитарные антитела. М.: Монолит, 2003. 128 с.)
8.  Harmon K, Hanson R, Bowen J, Greenberg S, Magaziner E, Vandenbosch J, et al. Guidelines for the use of platelet rich plasma. URL: https://www.scribd.com/document/159334949/206-ICMS-Guidelines-for-the-Use-of-Platelet-Rich-Plasma-Draftob-oasbonasdandbowndoww
9.  Clinical Indications and Treatment Protocols with Platelet-Rich Plasma in Dermatology. Conde Montero E: PRP in wound healing; in Alves R, Grimalt R (eds). Barcelona, Ediciones Mayo, 2016. P. 59-72
10. Cognasee F, Hamzen-Cognasse H, Lafarge S, Acquart S, Chavarin P, Courbil R, et al. Donor platelets stored for at leasts 3 days can elicit activation marker expression by the recipient is blood mononuclear cells: an in vitro study. Transfusion.2009; 49(1): 91-98
11. Korotkich NN, Aralova MV, Ostroushko AP, Shipilova VV et.al. Immuno-biological rationale for the use of platelet-rich donor plasma for the regional treatment of wounds. Herald of Experimental and Clinical Surgery. 2017; 10(2): 111-115. Russian (Коротких Н.Н., Аралова М.В., Остроушко А.П., Шипилова В.В. Иммунобиологическое обоснование применения обогащенной тромбоцитами донорской плазмы для регионального лечения ран // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. 2017. Т. 10, № 2. С. 111-115)
12. A method for producing platelet-rich autoplasm: pat. No. 2305563 RF, MPKA61M 1/36, A61K 35/16, A61K 35/14. /V.L. Brekhov; applicant and patent holder Samoday V.G. – No. 2005125929/15; application. 15.08.2005; publ. 20.02.2007, Bul. No. 25. – 3 p. Russian (Способ получения богатой тромбоцитами аутоплазмы: пат. № 2305563 РФ, МПК А61М 1/36, А61К 35/16, А61К 35/14. /В.Л. Брехов; заявитель и патентообладатель Самодай В.Г. № 2005125929/15; заявл. 15.08.2005; опубл. 20.02.2007, Бюл. № 25. – 3 с.)
13. Samoday VG et al. The use of platelet-enriched autoplasma for treatment of pseudoarthrosis and infected defects of bone tissue. Actual issues of tissue and cellular transplantology: materials of 3rd All-Russian international symposium. Moscow, 25-26 April 2007. 148-150. Russian (В.Г. Самодай и др. Использование богатой тромбоцитами аутоплазмы в лечении псевдоартрозов и инфицированных дефектов костной ткани //Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии: матер. III Всерос. симпозиума с междунар. участ., г. Москва, 25-26 апреля 2007 г. М., 2007. С. 148-150)
14. Samoday VG, Brekhov VL, Gaydukov VE, Rylkov MI, Fedorishchev AP. The use of platelet-rich autoplasma in the surgical treatment of bone defects with a violation of bone continuity. Scientific Medical Herald of Central Black Earth Region. 2007; (30): 175-180. Russian (Самодай В.Г., Брехов В.Л., Гайдуков В.Е., Рыльков М.И., Федорищев А.П. Использование богатой тромбоцитами аутоплазмы в хирургическом лечении дефектов костной ткани с нарушением непрерывности кости //Научно-медицинский вестник Центрального Черноземья. 2007. № 30. С. 175-180)
15. Samoday VG, Brekhov VL, Gaydukov VE. The use of platelet-rich autoplasma (BTTP) in the surgical treatment of bone defects with a violation of bone continuity. Systemic Analysis and Management in Biomedical Systems. 2007; 6 (2): 493-495. Russian (Самодай В.Г., Брехов В.Л., Гайдуков В.Е. Использование богатой тромбоцитами аутоплазмы (БОТП) в хирургическом лечении дефектов костной ткани с нарушением непрерывности кости //Системный анализ и управление в биомедицинских системах. 2007. Т. 6, № 2. С. 493-495)
16. Ryabinin SV, Samoday VG. Comparative clinical analysis of viscosupplementary and traditional methods of treatment of osteoarthritis of knee joints. Medical Board. 2017; (20): 131-133. Russian (Рябинин С.В., Самодай В.Г. Сравнительный клинический анализ вискосапплементарных и традиционного методов лечения остеоартроза коленных суставов //Медицинский совет. 2017. № 20. С.131-133)
17. Polesskiy MG, Samoday VG, Ryabinin SV. Experimental substantiation of the use of a lyophilizate of a complex of autologous platelet growth factors (autoltfr) for the treatment of patients with false joints of the tubular bones of the lower limb. Herald of Voronezh State University. Series: Chemistry. Biology. Pharmacy. 2016; (1): 109-111. Russian (Полесский М.Г., Самодай В.Г., Рябинин С.В. Экспериментальное обоснование применения лиофилизата комплекса аутогенных тромбоцитарных факторов роста (аутолтфр) для лечения больных с ложными суставами трубчатых костей нижней конечности //Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2016. № 1. С. 109-111)
18. Technology of liophilisation of platelet-enriched plasma with preservation of vital activity of TGF, PDGF and VEGF: patent No. 2506946 RF, MPKA61K9/19, A61K38/18, A61L15/44, B01J3/00 Samoday VG, Poleskiy MG; applicant and patent holder Voronezh State Medical Academy named after Burdenko. No. 2012151106/15; application 28.11.2012; published on. 20.02.2014, Bulletin. No. 25. 3 p Russian (Технология лиофилизации обогащённой тромбоцитами плазмы с сохранением жизнеспособности факторов TGF PDGF VEGF: пат. № 2506946 РФ, МПКA61K9/19, A61K38/18, A61L15/44, B01J3/00 /Самодай В.Г., Полесский М.Г.; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко. № 2012151106/15; заявл. 28.11.2012; опубл. 20.02.2014, Бюл. № 25. 3 с.)
19. Goldstein DR, Tesar BM, Akira S, Lakkis FG. Critical role of the Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 in acute allograft rejection. J. Clin. Invest. 2003; 111(10): 1571-1578
20. Zybleva SV, Zyblev SL. Immunological mechanisms of activation of congenital and adaptive immunity systems in allotransplantation. Immunopathology, Allergology, Infectology. 2015; (2): 11-23. Russian (С.В. Зыблева, С.Л. Зыблев. Иммунологические механизмы активации врожденной и адаптивной систем иммунитета при аллотрансплантации //Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2015. № 2. C. 11-23)
21. Kodenev AT, Vashchenko GA, Kapustov VI. Zhiburt EB. Improving the production of platelet concentrate. Herald of Blood Banking of Russia. 2010; (2): 22-25. Russian (Коденев А.Т., Ващенко Г.А., Капустов В.И. Жибурт Е.Б. Совершенствование получения концентрата тромбоцитов //Вестник службы крови России. 2010. № 2. С. 22-25)
22. Schiffer CA. Management of alloimmunized, refractory patients in need of platelet transfusions. Vox Sang. 1997; 73: 197-198
23. Jo C.H, Shin J.S, Lee S.Y, Shin S. Allogeneic platelet-rich plazma for rotator cuff repair. ActaOrtop Bras. 2017; 25(1): 38-43. doi: 10.1590/1413-78
24. Rocha MAC, Silva LMC, Oliveira WA, Bezerra DO, Silva GCD, Silva LDS, et al. Allogeneic mesenchymal stem cells and xenogenic platelet rich plasma, associated or not, in the repair of bone failures in rabbits with secondary osteoporosis. Acta Cir Bras. 2017; 32(9): 767-780. doi: 10.1590/s0102-865020170090000009
25. Abouelnasr K, Hamed M, Lashen S, El-Adl M, Eltaysh R, Tagawa M. Enhancement of abdominal wall defect repair using allogenic platelet-rich plasma with commercial polyester\cotton fabric (Damour) in a canine model. J Vet Med. Sci. 2017; 79(7): 1301-1309
26. Chen FC, Chen MC, Yan TT, Hou JJ. Yang JG. Effects and mechanism of allogeneic platelet rich plasma on collagen synthesis in wound healing. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 2017; 55(4): 303-307
27. Vaza AYu, Makarov MS, Slastinin VV, Borovkova NV, Klyukvin IYu, Pokhitonov DYu, et al. The efficacy of a combination of allogeneic platelet-rich plasma with collagen in the treatment of femoral defects in rats. Transplantology.2016; (2): 36-44. Russian (Ваза А.Ю., Макаров М.С., В.В. Сластинин, Боровкова Н.В., Клюквин И.Ю., Похитонов Д.Ю. и др. Эффективность комбинации аллогенной богатой тромбоцитами плазмы с коллагеном при лечении дефектов бедренной кости у крыс //Трансплантология. 2016. № 2. С. 36-44)
28. Gusarov DA. Lyophilization of biopharmaceutical proteins (mini-review). Biopharmaceutical Journal. 2010; 2(5): 3-7. Russian (ГусаровД.А. Лиофилизация биофармацевтических белков (миниобзор) //Биофармацевтический журнал. 2010. Т. 2, № 5. С. 3-7)
29. Patent No. 13171495. Application date: 11.06.2013. Publication number: 2813232. Publication date: 17.12.2014. Publication type: B1. Applicators: DOTGMBH. Inventors: NEUMANNHANS-GEORG, NEUMANNBARBARA. Priority date: 13171495 11.06.2013 EP. (EN) Process of Production of Allogenic Growth Factor Extract. Russian (Пат № 13171495 Дата заявки: 11.06.2013. Номер публикации: 2813232. Дата публикации: 17.12.2014. Вид публикации: B1 Заявители: DOTGMBH Изобретатели: NEUMANNHANS-GEORG, NEUMANNBARBARA. Дата приоритета: 13171495 11.06.2013 EP .(EN) Process of Production of Allogenic Growth Factor Extract)
30. Ding W, Knox TR, Tschumper RC, Wu W, Schwager SM, Boysen JC, et al. Platelet-derived growth factor (PDGF)-PDGF receptor interaction activates bone marrow-derived mesenchymal stromal cells derived from chronic lymphocytic leukemia: implications for an angiogenic switch. Blood. 2010; 116(16): 2984-2993
31. Siegbahn A, Hammacher A, Westermark B, Heldin CH. Differential effects of the various isoforms of platelet-derived growth factor on chemotaxis of fibroblasts, monocytes, and granulocytes. J. Clin. Invest. 1990. 85(3): 916-920
32. Mathematical encyclopedia. Edited by Vonogradov IM. M.: Soviet Encyclopedia, 1977; 2921 p. Russian (Математическая энциклопедия /под ред. И.М. Виноградова. М.: Советская энциклопедия, 1977. 2921 с.)
33. Zapadnyuk IP, Zapadnyuk VI, Zakhariya EA, Zapadnyuk BV. Laboratory animals. Breeding, management and use in experiment. Kiev, 1983. 383 p. Russian (Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А.,Западнюк Б.В. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. Киев, 1983. 383 с.)
34. Messora MR, Nagata MJH, Furlaneto FAC, Dornelles RCM, Bomfim SRM, Deliberador TM, et al. A standardized research protocol for platelet-rich plasma (PRP) preparation in rats. RSBO. 2011; 8(3): 299-304

Статистика просмотров

Ссылки

• На текущий момент ссылки отсутствуют.