Отправить письмо автору 
Написать комментарий 
Муханов М.Л., Блаженко А.Н., Афаунов А.А., Богданов С.Б., Сотниченко А.С., Русинова Т.В., Алиев Р.Р.
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Краснодар, Россия
ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОСТНОГО АУТОРЕГЕНЕРАТА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
В настоящее время в связи с ростом
уровня травматизма [1] и возрастающей частотой переломов, сопровождающихся
дефектом костной ткани [2-4], возникает необходимость не только в сокращении
сроков консолидации переломов [3], но и остеоиндуктивном материале, позволяющем
выполнять замещение костных дефектов больших объемов.
В арсенале травматолога-ортопеда имеется
ряд методов лечения переломов, сопровождающихся дефектом костной ткани,
признаками замедленной консолидации или формирующегося ложного сустава. Эти
методы могут быть использованы как самостоятельно, так и в сочетании, например,
дистракцио-компрессионный остеосинтез [5, 6], а также ряд различных методов
костной пластики, таких как аутологичные костные трансплантаты,
аллотрансплантаты и заменители костных трансплантатов [7, 8].
Другим направлением оптимизации
процессов репаративного остеогенеза является костно-тканевая инженерия –
перспективное направление персонифицированной медицины. Достижения тканевой
инженерии применяются во множестве специальностей, в том числе и в
травматологии и ортопедии, где для замещения дефектов костной ткани используют
синтетические каркасы с нанесенными на них клетками и факторами роста. Однако в
данном направлении не решено много вопросов эффективности, безопасности и
стоимости, что не позволяет на данном этапе широко внедрить эти методы в
практическую медицину [9, 10].
Наиболее широкое распространение получили
методы локальной стимуляции репаративного остеогенеза с использованием факторов
роста [2, 3, 11]. К ним относятся применение обогащенной тромбоцитами плазмы
(platelet-richplasma – PRP) [2], введение
в зону перелома концентрата взвеси аспирата костного мозга (bone marrow aspirate concentrate – BMAC) [3, 11], использование факторов роста, полученных
синтетическим путем, таких как костные морфогенетические белки (bone morphogenetic
proteins – BMPs) [3], фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor
– FGF) [3] и др.
Большинство современных стратегий
ускорения регенерации костной ткани дают относительно удовлетворительные
результаты, что подтверждают противоречивые публикации об их клинической и
экономической эффективности [13]. Кроме того, в настоящее время не существует
гетерологичных или синтетических заменителей кости, которые обладали бы более
высокими или даже одинаковыми биологическими или механическими свойствами по
сравнению с костью. Поэтому существует необходимость разработки новых методов
локальной стимуляции репаративного остеогенеза с использованием факторов роста
в качестве дополнения к стандартным методам лечения переломов [2, 3, 14].
Цель – в
условиях in vitro определить соотношение основных факторов роста в зоне активного
репаративного остеогенеза и провести сравнительный анализ с известными методами
локальной стимуляции репаративного остеогенеза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Настоящее
исследование было выполнено на лабораторных животных: бараны породы «Романовская»
– две головы в возрасте старше 1 года, массой 31,2 кг и 28,6 кг.
Все
манипуляции с животными проводили согласно правилам, принятым Европейской
конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований и
других научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123) Strasbourg, 1986),
была проведена экспертиза исследования в независимом этическом комитете ФГБОУ
ВО КубГМУ Минздрава России (протокол № 80 от 27.09.2019 г.).
В
соответствии с дизайном исследования сравнительному анализу были подвергнуты
биологические среды, взятые у лабораторных животных и используемые для
локальной стимуляции репаративного остеогенеза, а именно концентрат взвеси
аспирата костного мозга (BMAC), обогащенная тромбоцитами плазма (PRP), нативная
плазма и ауторегенерат.
Получение ауторегенерата было
выполнено по оригинальной методике следующим образом: после выполнения доступа
при помощи долота произведена остеотомия в области гребня крыла подвздошной
кости и сформирована костная рана (рис. 1) длиной до 50,0 мм, шириной до
10,0 мм и глубиной до 30,0 мм (15000 мм3 = 15,0 мл),
в которой из гематомы в течение 5-7 суток формировался ауторегенерат,
представляющий собой «организующийся» сгусток (рис. 2), часть которого была
взята для проведения иммуноферментного и морфологического анализа с целью
определения количества факторов роста и клеточного состава в образце
регенерата.
Рисунок
1. Остеотомия крыла
подвздошной кости
Рисунок 2. Ауторегенерат,
полученный из крыла подвздошной кости
Для
получения красного костного мозга была выполнена пункция крыла подвздошной
кости с забором красного костного мозга в объеме 15-20 мл, а также забор
крови для приготовления обогащенной тромбоцитами плазмы и нативной плазмы
крови, была выполнена венепункция с забором венозной крови в объеме 15-20 мл.
Обогащение
плазмы тромбоцитами проводили при помощи настольной центрифуги Hettich Eba 20
по технологии «Плазмолифтинг» с применением пробирок, содержащих сепарационный
гель.
Иммунологические
и гистоморфологические исследования проводили в центральной
научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России.
Осуществлялся
иммуноферментный анализ на концентрацию следующих цитокинов: тромбоцитарный
фактор роста АВ (Platelet Derived Growth Factor AB (PDGFAB)), трансформирующий
фактор роста b (Transforming Growth Factor Beta 1 (TGFb1)), костный
морфогенетический белок 6 (Bone Morphogenetic Protein 6 (BMP6)), костный
морфогенетический белок 7 (Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7)),
инсулиноподобный фактор роста (Insulin Like Growth Factor 1 (IGF1)),
фактор роста фибробластов (Fibroblast Growth Factor 1 (FGF1)) был проведен
методом ELISA с помощью соответствующих тест-систем (Cloud-Clone Corp, США): SEA436Ov
ELISA Kit For Platelet Derived Growth Factor AB, SEA124Ov ELISA Kit For Transforming
Growth Factor Beta 1, SEA646Ov ELISA Kit for Bone Morphogenetic Protein 6,
SEA799Ov ELISA Kit for Bone Morphogenetic Protein 7, SEA050Ov ELISA Kit for
Insulin Like Growth Factor 1, SEA032Ov ELISA Kit for Fibroblast Growth Factor
Acidic в соответствии с протоколом фирмы-производителя на микропланшетном ридере
Filter Max F5 (США).
По каждому
биологическому образцу было выполнено по 4 измерения, данные представлены
в виде медианы, первого и третьего квартиля (Me [Q1; Q3]).
Гистоморфологическую
оценку тканей проводили по общепринятому алгоритму. Биологический материал
фиксировали в течение 3-5 суток в 10 % растворе нейтральном
забуференом формалине (Histolab, Швеция), промывали в проточной
воде в течение 60 мин. Проводку материалов осуществляли по стандартной
методике автоматическим методом на гистопроцессоре Leica TP1020 (Германия).
Парафиновые блоки с образцами исследуемых материалов готовили на модульной
установке Leica EG1150H (Германия), для нарезки препаратов использовали ротационный
микротом Leica RM2235 (Германия). Полученные срезы материала толщиной 5 мкм
окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Микроскопию
препаратов проводили при помощи микроскоп аOlympus СX41 (Япония).
Статистическую
обработку результатов исследования выполняли с помощью программы StatSoft 2009
(США). Поскольку выборка была небольшой и распределение не отличалось от
нормального, результаты представлены в виде медианы, первого и третьего
квартиля (Me [Q1; Q3]). Достоверность различий оценивали с помощью U-критерия
Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Впервые получены экспериментальные данные по количественному содержанию цитокинов: PDGFАВ, TGFb, FGF1, IGF, BMP6 и BMP7 в костном ауторегенерате, которые отражают физиологическое соотношение факторов, участвующих в локальной стимуляции репаративного остеогенеза, что может быть использовано в терапевтических и диагностических целях. Кроме того, проведено определение концентрации соответствующих показателей в плазме крови, в плазме, обогащенной тромбоцитами, и взвеси аспирата костного мозга (BMAC). Полученные результаты, представленные графически в таблице.
Таблица. Содержание цитокинов, регулирующих остеосинтез и репарацию, в различных биологических образцах барана (Me [Q1; Q3])
|
Биологические образцы Цитокины |
Костный
ауторегенерат |
Взвесь
аспирата костного мозга (BMAC) |
Плазма, обогащенная тромбоцитами |
Плазма крови |
|
Инсулиноподобный фактор роста (IGF1), нг/мл |
17.2 |
40.9* |
6.7# |
0^ |
|
Фактор роста фибробластов (FGF1), пг/мл |
8.96 |
6.11* |
0# |
3.07^ |
|
Трансформирующий фактор роста b (TGFb), пг/мл |
16.66 |
34.74* |
0# |
16.16 |
|
Тромбоцитарный фактор роста АВ (PDGFAB), нг/мл |
2.67 |
2.52 |
7.22# |
3.05 |
|
Костный морфогенетический белок 6 (BMP6), пг/мл |
57.30 |
96.50* |
23.15# |
26.02^ |
|
Костный морфогенетический белок 7 (BMP7), пг/мл |
1736.50 |
1086.00* |
300.00# |
366.50^ |
Примечание: * – значимость различий между ауторегенератом и BMAC – р < 0,05; # – значимость различий между ауторегенератом и PRP – р < 0,05; ^ – значимость различий между ауторегенератом и плазмой крови – р < 0,05.
Из полученных данных видно, что в костном
ауторегенерате преобладают такие цитокины, как
фактор роста фибробластов 1 – FGF1 (р = 0,026; p =
0,001; p = 0,009 в отношении BMAC, PRP,
нативной плазмы соответственно) и костный морфогенетический белок 7 – BMP7 (р =
0,043; р = 0,009; р = 0,009 в отношении BMAC, PRP, нативной плазмы
соответственно) по сравнению со всеми исследуемыми биологическими образцами, что
обуславливает ключевую роль этих факторов в формировании соединительной ткани в
ходе репаративного остеогенеза. Остальные показатели в ауторегенерате значимо
разнонаправленно отличаются по отношению к другим исследуемым биологическим
образцам, что демонстрирует специфичность функций всех изучаемых цитокинов в
поддержании гомеостаза на тканевом и системном уровнях. Следует отметить, что
обогащенная тромбоцитами плазма содержит большое количество фактора роста
тромбоцитов АВ – PDGFАВ (р = 0,07; р = 0,012; р = 0,043
соответственно для BMAC, PRP, нативной плазмы), что как минимум в 2 раза
выше в сравнении с другими биологическими средами. Во взвеси аспирата костного
мозга преобладает концентрация следующих цитокинов: TGFb (р = 0,048; р =
0,001; р = 0,048 в отношении BMAC, PRP, нативной плазмы соответственно) и
BMP6 (р = 0,012; р = 0,041; р = 0,033 в отношении BMAC, PRP,
нативной плазмы соответственно).
Для
визуализации и сравнения профилей цитокинов в изучаемых биологических образцах
значение концентраций цитокинов в костном ауторегенерате было взято за 100 процентов,
и построена диаграмма (рис. 3).
Рисунок 3. Сравнительный
анализ профиля цитокинов в костном ауторегенерате, красном костном мозге (BMAC),
плазме, обогащенной тромбоцитами (PRP), и плазме крови (в процентах,
относительно значений для костного ауторегенерата)
Примечание: *, #, ^ – значимость различий – р < 0,05 во всех биологических образцах по отношению к показателям ауторегенерата.
Анализ
диаграммы показал, что профили цитокинов в плазме и плазме, обогащенной
тромбоцитами, достаточно близки по сравнению с данными для костного мозга, за
исключением PDGFАВ, возрастание концентрации которого, по-видимому, объясняется
высоким содержанием активированных тромбоцитов. Полученные данные
свидетельствуют о малой роли фактора роста тромбоцитов и трансформирующего
фактора роста в репарации костной ткани и о нецелесообразности применения
плазмы, обогащенной тромбоцитами при лечении дефектов костной ткани. Наиболее
близкой к ауторегенерату по содержанию факторов роста является взвесь красного
костного мозга, при этом относительно высокое содержание IGF1 и TGFb может быть
обусловлено процессами усиленного образования костного матрикса за счет
стимуляции синтеза коллагена.
Таким
образом, в ауторегенерате, по своей сути представляющем организующуюся гематому
в области перелома, в ходе данного эксперимента нами выявлено оптимальное
соотношение основных цитокинов, необходимых для оптимизации процессов
репаративного остеогенеза: FGF1 – 8,96 пг/мл, BMP7 – 1736,5 пг/мл,
IGF1 – 17,2 нг/мл, TGFb – 16,66 пг/мл, BMP6 – 57,3 пг/мл, PDGF –
2,67 нг/мл; данные представлены на диаграмме (рис. 3).
В ходе
гистологического анализа ауторегенерата было обнаружено, что образцы были
имбибированы фибрином, в инфильтрате выявлялись клетки мононуклеарного ряда,
также обнаруживалось большое количество пролифирирующих фибробластов и
новообразованных тонкостенных капилляров по всей плоскости среза с
формированием грануляционной ткани, что может являться следствием большого
содержания фактора роста фибробластов в испытуемых образцах (рис. 4а, 4b).
Рисунок 4. Гистологическое
исследование. Фрагмент регенерата, полученного на 7-е сутки: а) увеличение
в ×10; b) увеличение ×20
Данные
морфологического анализа свидетельствуют о высокой репаративной активности в
зоне получения ауторегенерата и о том, что его трансплантация будет
способствовать стимуляции остеогенеза. На основании иммуноферментного и
морфогистологического анализа ауторегенерата можно заключить, что он является
эффективным и перспективным средством локальной стимуляции репаративного остеогенеза.
Поэтому необходимо его дальнейшее изучение на экспериментальных моделях
(животных) и оценка возможностей практического применения полученных
результатов.
Таким
образом, в результате проведенного исследования было установлено отличие ауторегенерата,
получаемого по оригинальной методике, от взвеси аспирата костного мозга (BMAC)
и существенное отличие от обогащенной тромбоцитами плазмы крови (PRP),
являющихся наиболее широко распространенными способами локальной стимуляции
репаративного остеогенеза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время в травматологии и
ортопедии применяется множество методик, позволяющих локально стимулировать
репаративную регенерацию костной ткани, из которых A-PRP-терапия является
наиболее распространенной, доступной и безопасной. С тромбоцитами связывают ряд
общих биологических эффектов, возникающих благодаря известным факторам роста
(трансформирующий фактор роста β – TGF-β, тромбоцитарный фактор роста – PDGF,
IGF-II, фактор роста эндотелия сосудов – VEGF, эпидермальный фактор роста –
EGF, фактор роста эндотелиальных клеток – ESGF, инсулиноподобный фактор роста –
IGF-I, фактор роста фибробластов – FGF), находящимся в а-гранулах; тромбоциты
включают ионы К+, Ca++, АТФ, АДФ, цитокины (серотонин, гистамин, допамин,
простагландины), факторы свертывания, хемокины, кислотные гидролазы, эластазы,
лизоцим, катепсин Д и Е, протеазы, а также антибактериальные и фунгицидные
белки.
Однако по данным, представленным в нашем
исследовании (рис. 3), обогащенная тромбоцитами плазма оказывает стимулирующее
влияние на репаративный остеогенез, но не обладает выраженными
остеоиндуктивными свойствами, а действие может быть объяснено природной способностью
тромбоцитов влиять на процессы заживления, стимулируя регенеративный потенциал
костной ткани за счет неспецифических факторов роста.
По данным нашего исследования, наибольший
потенциал стимуляции репаративного остеогенеза показали красный костный мозг и
ауторегенерат, полученный по оригинальной методике. На основании данных
иммуноферментного анализа были определены качественные и количественные
показатели факторов роста, необходимые для оптимизации процессов репаративного остеогенеза.
Причем показатели относительно качественных результатов, полученных нами,
совпадают с результатами, опубликованными и другими исследователями [15],
относительно значения для регенерации костной ткани таких цитокинов, как TGF,
представляющих собой большую группу белков, среди которых TGF-P1 и BMPs [16,
17].
Таким образом, применение ауторегенерата с
целью оптимизации процессов репаративного остегенеза можно отнести к одному из
наиболее безопасных методов локальной стимуляции процессов остеогенеза на
основе следующих преимуществ: абсолютная биосовместимость; минимальный риск
возникновения инфекции; содержание цитокинов в оптимальном соотношении для
локальной стимуляции репаративного остеогенеза.
Возможности применения данной технологии в
клинической медицине, а именно в травматологии и ортопедии, требуют дальнейших
исследований, направленных на создание протоколов выполнения предложенной
процедуры.
ВЫВОДЫ:
Основываясь
на результатах сравнительного иммуноферментного анализа ауторегенерата, в ходе
эксперимента нам удалось определить оптимальную концентрацию основных факторов
роста, стимулирующих репаративный остеогенез: FGF1 – 8,96 пг/мл, BMP7 –
1736,5 пг/мл, IGF1 – 17,2 нг/мл, TGFb – 16,66 пг/мл, BMP6 – 57,3 пг/мл,
PDGF – 2,67 нг/мл.
Основываясь
на результатах иммуноферментного и морфогистологического анализа ауторегенерата
можно заключить, что он является эффективным и перспективным средством
локальной стимуляции репаративного остеогенеза.
Информация о финансировании и конфликте интересов
Исследование
выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-415-233004/19
(20) «р_мол_а» от 22.04.2019 г.
Авторы декларируют отсутствие явных и
потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Alekseenko SN, Redko AN,
Karipidi RK, Zakharchenko YuI. Primary disability of the adult population of
the Krasnodar territory duetoroad accidents // Bulletin of the All-Russian Society of Specialists in Medical and
Social Expertise, Rehabilitation and Rehabilitation Industry. 2017; (4): 44-48. Russian (Алексеенко С.Н., Редько А.Н.,
Карипиди Р.К., Захарченко Ю.И. Первичная инвалидность взрослого населения
краснодарского края вследствие дорожно-транспортных происшествий //Вестник
Всероссийского общества специалистов по медико-социальной экспертизе,
реабилитации и реабилитационной индустрии. 2017. № 4. С. 44-48)
2. Blazhenko
AN, Rodin IA, Ponkina ON, Mukhanov ML, Samoylova AS, Verevkin AA, et al. The effect of A-PRP therapy on the reparative regeneration of bone
tissue in fresh fractures of limb bones. Innovative
Medicine of the Kuban. 2019; № 15(3): 32-38. Russian (Блаженко А.Н., Родин И.А., Понкина О.Н., Муханов М.Л., Самойлова А.С., Веревкин А.А. и др. Влияние A-PRP-терапии на
репаративную регенерацию костной ткани при свежих переломах костей конечностей
//Инновационная медицина Кубани. 2019. 3(15). C. 32-38)
3. Sadykov RI, Akhtyamov IF,
Local factors of reparative osteogenesis stimulation (literature review). Department of Traumatology and Orthopedics.
2020; (3): 23-30. Russian (Садыков Р.И., Ахтямов И.Ф., Локальные факторы стимуляции репаративного остеогенеза (обзор литературы) //Кафедра травматологии и ортопедии. 2020. № 3.
С. 23-30)
4. Shastov AL. The problem of
replacement of post-traumatic defects of long bones in the domestic
traumatological and orthopedic practice (literature review). Genius of Orthopedics. 2018;
24(2): 252-257. Russian (Шастов А.Л. Проблема замещения посттравматических
дефектов длинных костей в отечественной травматолого–ортопедической практике
(обзор литературы) //Гений ортопедии. 2018. Т. 24, № 2. С. 252-257)
5. Aronson J.
Limb-lengthening, skeletal reconstruction, and bone transport with the Ilizarov
method. J Bone Joint Surg Am. 1997;
79(8): 1243-1258
6. Green SA,
Jackson JM, Wall DM, Marinow H, Ishkanian J. Management of segmental defects by
the Ilizarov intercalary bone transport method. Clin Orthop Relat Re. 1992; 28: 136-142
7. Giannoudis PV,
Dinopoulos H, Tsiridis E. Bone substitutes: an update. Injury. 2005; 36 (Suppl 3): 20-27
8. Giannoudis PV,
Einhorn TA. Bone morphogenetic proteins in musculoskeletal medicine. Injury. 2009; 40 (Suppl 3): 1-3
9. Salgado AJ, Coutinho OP, Reis RL. Bone tissue engineering: state of the
art and future trends. Macromol Biosci.
2004; 4(8): 743-765. 10.1002/mabi.200400026
10. Rose FR, Oreffo
RO. Bone tissue engineering: hope vs hype. Biochem
Biophys Res Commun. 2002; (2): 1-7. doi: 10.1006/bbrc.2002.6519
11. Korzh NA,
Vorontsov PM, Vishnyakova IV, Samoilova EM. Innovative methods for optimizing
bone regeneration: mesenchymal stem cells (message 2) (literature review) Orthopedics, Traumatology and Prosthetics.
2018;
(1): 105-116. Russian (Корж Н.А.,
Воронцов П.М., Вишнякова И.В., Самойлова Е.М. Инновационные методы оптимизации
регенерации кости: мезенхимальные стволовые клетки (сообщение 2) (обзор
литературы) //Ортопедия, травматология и протезирование. 2018. № 1. С.
105-116)
12. Akhtyamov IF,
Zhitlova EA, Tsyplakov DE, Boychuk SV, Shakirova FV, Korobeynikova DA. X-ray
morphological parallels of the osteoregenerative process when using a drug
based on lanthanide ethidronates.
Polytrauma.
2017; (4): 16-22. Russian (Ахтямов И.Ф., Житлова Е.А., Цыплаков Д.Э., Бойчук С.В., Шакирова
Ф.В., Коробейникова Д.А. Рентгеноморфологические параллели
остеорегенеративного процесса при использовании препарата на основе этидронатов
лантаноидов //Политравма. 2017. № 4. С. 16-22)
13. Piuzzi
NS, Dominici M, Long M, Pascual-Garrido C, Rodeo S, Huard J, et al. Proceedings
of the signature series symposium «cellular therapies for orthopaedics and
musculoskeletal disease proven and unproven therapies-promise, facts and
fantasy», international society for cellular therapies, Montreal, Canada, May
2, 2018. Cytotherapy. 2018; 20(11): 1381-1400.
doi: 10.1016/j.jcyt.2018.09.001
14. Talashova IA,
Osipova NA, Kononovich NA. Comparative quantitative assessment of the
reparative process during implantation of biocompositional materials in bone
defects. Genius of Orthopedics. 2012; (2): 68.
Russian (Талашова И.А.,
Осипова Н.А., Кононович Н.А. Сравнительная количественная оценка репаративного
процесса при имплантации биокомпозиционных материалов в костные дефекты //Гений
ортопедии. 2012. № 2. С. 68)
15. Pavlova LA, Pavlova TV,
Nesterov AV. Modern understanding of osteoinductive mechanisms of bone tissue
regeneration. Review of the state of the problem. Actual Problems of Medicine. 2010; 10(81): 5-11. Russian (Павлова Л. А., Павлова Т. В.,
Нестеров А. В. Современное представление об остеоиндуктивных механизмах
регенерации костной ткани. Обзор состояния проблемы //Актуальные проблемы
медицины. 2010. № 10(81). С. 5-11)
16. Andrades
JA, Han B, Nimni ME, Ertl DC, Simpkins RJ, Arrabal MP, et al. A modified
rhTGF-beta1 and rhBMP-2 are effective in initiating a chondro-osseous
differentiation pathway in bone marrow cells cultured in vitro. Connect Tissue Res. 2003; 44(3-4): 188-97.
doi: 10.1080/03008200390229912
17. Lieberman
JR, Daluiski A, Einhorn TA. The role of growth factors in the repair of bone.
Biology and clinical applications. J Bone
Joint Surg Am. 2002; 84(6): 1032-1044. doi:
10.2106/00004623-200206000-00022
Статистика просмотров
Ссылки
- На текущий момент ссылки отсутствуют.
